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成功的IHC/ICC实验操作指南(八)

实验的每一小步,都是决定结果的一大步。本期将为大家讲解抗原修复的重要性,喜欢的话就继续往下看吧!

尽管固定对于组织形态的保留是必不可少的,但这一过程对IHC/ICC检测也有不良影响。固定可能改变蛋白的生化特性,如目的表位被掩盖不再与一抗结合。表位的掩盖可能是由表位内氨基酸的交联、表位或附近位点与无关肽段的交联、表位构象的改变或抗原静电荷的改变引起的。抗原修复指的是任何可以逆转表位掩盖和恢复表位-抗体结合的技术。

抗原修复技术

抗原修复的需要取决于多个变量,包括但不限于,目的抗原、所使用的抗体、组织类型,以及固定方法和持续时间。多克隆抗体能识别多个表位,因此即使不进行抗原修复,它们也比单克隆抗体更有可能检测到特定抗原。

目前有多种技术可恢复表位的免疫反应性。简单的方法有改变抗体稀释液的ρH或阳离子浓度,这可能影响抗体与表位的亲和力。对于部分掩盖的表位,在开始抗原修复之前可以先试试改变一抗的孵育条件。不过,这一步也需要抗体浓度、孵育时间和温度的进一步优化。在讨论抗体修复方法时,技术通常分为两大类,蛋白酶诱导的表位修复(PIER)和热诱导的表位修复(HIER)。一旦优化好,抗原修复的影响可以是明显的。

蛋白酶诱导的表位修复(PIER)

在PIER方法中,蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶等都曾成功恢复抗体与表位的结合。人们认为作用机制是切割了可能遮盖表位的肽段。PIER的缺点在于恢复免疫反应性的成功率低,且有可能破坏组织形态和目的抗原。

热诱导的表位修复(HIER)

HIER被认为能逆转一些交联,并实现表位二级或三级结构的重建。实验方案必须针对每种组织、固定方法和待研究抗原进行优化。总的来说,HIER的成功率比PIER要高得多。

HIER可利用微波炉、高压锅、蒸屉、高压灭菌锅或水浴开展。在HIER实验中,微波炉是越来越流行的设备。这些方案大多加热5分钟,然后更换缓冲液。对于所有HIER方法,在开始IHC/ICC孵育之前必须让玻片冷却。HIER对时间、温度、缓冲液和pH特别敏感,最佳方法必须根据经验确定。

优化和局限性

抗原修复可能需要加强样品与玻片或盖玻片的附着。此外,此技术对于冰冻组织切片和醇固定切片通常过于剧烈。对于每种设备,时间、温度和pH必须经过优化(如92-95°C水浴要5-10分钟,而120°C高压锅要1-5分钟)。为了优化抗原修复,必须开展预实验,使用时间、温度和pH的各种组合。在使用抗原修复方法时,应始终考虑到假阳性的可能性。实验应当包含对照,以证明特异的抗体结合,因为染色常受到实验中多个变量的影响。

R&D Systems提供了一些试剂,可改善组织抗原检测,并增强免疫反应性。在初次优化时,研究人员可比较经中性pH7.0通用抗体修复液(货号CTS015)处理的样品和未经过抗原修复的同一组织样品。之后可能需要使用酸性或碱性的抗原修复液,这取决于组织。在R&D Systems,我们发现碱性抗原修复液(货号CTS013)的处理通常很成功。我们也提供酸性(货号CTS014)以及试用装(货号CTS016)的抗原修复液。与中性溶液相比,酸性和碱性抗原修复液更可能影响组织形态。

以上文字和图片来源于Bio-techne。

 

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